Browsing by Author "Figueroa Alegría, Juan David"

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    Protein quantification by bicinchoninic acid (BCA) assay follows complex kinetics and can be performed at short incubation times
    (2020) Cortés Ríos, Javiera Alejandra; Zárate Méndez, Ana María; Figueroa Alegría, Juan David; Medina, J.; Fuentes Lemus, Eduardo Felipe; Rodríguez Fernández, María; Aliaga Miranda, Margarita Elly; López Alarcón, Camilo Ignacio
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    Rol de triptófano y tirosina en las modificaciones oxidativas de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa inducidas por radicales peroxilo y anión radical carbonato
    (2022) Figueroa Alegría, Juan David; López Alarcón, Camilo Ignacio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Química
    La enzima Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) cumple un rol importante en sistemas biológicos. Es la primera enzima de la ruta de las pentosas fosfato, vía fundamental para la síntesis de nucleótidos y para la producción de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido (NADPH), cofactor clave para mantener la homeostasis redox intracelular. Aunque se ha sugerido en sistemas biológicos una relación entre los niveles de especies reactivas (ERO) y la actividad de G6PD, son pocos los estudios que han investigado la oxidación de esta enzima y sus consecuencias funcionales. En el presente trabajo de tesis se planteó como hipótesis que las modificaciones oxidativas sobre G6PD, mediadas por radicales peroxilo (ROOl) y radical anión carbonato (CO3l–), dependen de la dosis de radicales y de la disponibilidad de residuos susceptibles a la oxidación. Tales procesos afectarían la actividad catalítica e inducirían cambios en la masa molecular de la proteína, con participación de Trp y Tyr en procesos de entrecruzamiento. En función de dicha hipótesis, se estudió la oxidación de aminoácidos libres (Trp y Tyr) y G6PD, con especial énfasis en la formación de especies di-Tyr, di-Trp y Tyr-Trp, como también en los mecanismos de inactivación de la enzima. Se desarrollaron metodologías por espectrometría de masas (UPLC-MS/MS) para detectar las especies entrecruzadas y se establecieron condiciones experimentales para modular la dosis de los radicales libres. Los resultados obtenidos demostraron que la exposición de Trp y Tyr a diferentes flujos radicalarios no mostró una relación con la formación de di-Tyr y di-Trp. En condiciones experimentales similares, la oxidación de G6PD se asoció con pérdida de la actividad enzimática mediante un proceso dependiente de la dosis, pero no del flujo radicalario. Se determinó una pérdida de 40% de actividad después de la incubación de la enzima con 60 mM de AAPH por 90 minutos. La inactivación de G6PD se relacionó con cambios en su contenido de estructura secundaria como también con un aumento de bolsillos hidrofóbicos. Estos fenómenos indicarían desplegamiento proteico probablemente relacionado con la oxidación de residuos específicos de Met y Trp. Esto último demostrado a través de experimentos desarrollados empleando cloramina T, un oxidante no biológico, específico de residuos de Met. Los resultados obtenidos permiten plantear que la exposición a oxidantes de G6PD conduce a la pérdida de su actividad catalítica lo que puede ser relevante a nivel celular. No obstante, se requieren nuevas investigaciones que permitan establecer, bajo condiciones celulares, la importancia de tales procesos.