Browsing by Author "Matute Torres, Tamara Francisca"

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    Artificial Symmetry-Breaking for Morphogenetic Engineering Bacterial Colonies
    (2017) Núñez Quijada, Isaac Natán; Matute Torres, Tamara Francisca; Del Valle, Ilenne D.; Kan, Anton; Choksi, Atri; Endy, Drew; Haseloff, Jim; Rudge, Timothy; Federici, Fernán
    Morphogenetic engineering is an emerging field that explores the design and implementation of self-organized patterns, morphologies, and architectures in systems composed of multiple agents such as cells and swarm robots. Synthetic biology, on the other hand, aims to develop tools and formalisms that increase reproducibility, tractability, and efficiency in the engineering of biological systems. We seek to apply synthetic biology approaches to the engineering of morphologies in multicellular systems. Here, we describe the engineering of two mechanisms, symmetry-breaking and domain-specific cell regulation, as elementary functions for the prototyping of morphogenetic instructions in bacterial colonies. The former represents an artificial patterning mechanism based on plasmid segregation while the latter plays the role of artificial cell differentiation by spatial colocalization of ubiquitous and segregated components. This separation of patterning from actuation facilitates the design-build-test-improve engineering cycle. We created computational modules for CellModeller representing these basic functions and used it to guide the design process and explore the design space in silico. We applied these tools to encode spatially structured functions such as metabolic complementation, RNAPT7 gene expression, and CRISPRi/Cas9 regulation. Finally, as a proof of concept, we used CRISPRi/Cas technology to regulate cell growth by controlling methionine synthesis. These mechanisms start from single cells enabling the study of morphogenetic principles and the engineering of novel population scale structures from the bottom up.
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    Desarrollo de un sistema modular de regulación de procesos genéticos y metabólicos vía CRISPRi para el control del comportamiento celular
    (2017) Matute Torres, Tamara Francisca; Federici, Fernán; Rudge, Timothy; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
    TALEN y CRISPR/Cas9 han revolucionado la ingeniería genética, permitiendo la regulación de cualquier gen de interés en el genoma de organismos. CRISPR interferencia (CRISPRi) es un método desarrollado a partir de CRISPR/Cas9 que permite controlar la expresión de genes, mediante la generación de un complejo que reconoce un sitio específico del ADN e interfiere con la unión de la ARN polimerasa y/o la elongación transcripcional (Larson et al., 2013). El sistema CRISPRi se compone de una proteína Cas9 sin actividad endonucleasa, llamada dead Cas9 “dCas9”, y un ARN guía (sgRNA) que tiene la función de asociar el complejo formado con el sitio específico que se desea regular. El sgRNA se compone de un esqueleto invariable al 3´, que interactúa con dCas9, y una zona de 20 nucleótidos al 5´ que interactúa con el ADN y puede ser diseñada de manera arbitraria por el usuario. En este trabajo se exploró la modularizacíón y caracterización del sistema CRISPRi para ser utilizado en la regulación temporal y espacial de procesos biológicos en poblaciones bacterianas. A través del diseño de diversos sgRNAs y elementos funcionales de ADN modulares, se logró la regulación del comportamiento celular tanto en cultivos líquidos como en cultivos sólidos. Posteriormente, se exploró la regulación de procesos celulares en subdominios espaciales en el interior de colonias bacterianas. Finalmente, se utilizó el sistema CRISPRi para la regulación del crecimiento de células localizadas en un grupo definido y controlado en el interior de colonias bacterianas. Estos resultados en conjunto mostraron la exitosa implementación modular y combinatorial del sistema CRISPRi para la regulación espacial y temporal de procesos biológicos en un sistema multicelular.
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    Herramientas de libre acceso para la detección de secuencias específicas en ADN ambiental
    (2023) Matute Torres, Tamara Francisca; Federici, Fernán; Ramírez Sarmiento, César Antonio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
    La conservación de los recursos naturales y la diversidad biológica representa un desafío urgente a abordar a nivel mundial. Dentro de los grandes problemas que afectan actualmente a la biodiversidad está la presencia de especies exóticas invasoras (EEI) en los ecosistemas naturales. Este factor no solo determina un gran deterioro en la diversidad biológica y daño ecosistémico, sino que también se traduce en importantes pérdidas económicas y amenazas zoonóticas. Dado que las posibilidades de controlar una especie invasora una vez que ha colonizado un lugar se vuelven escasas, las recomendaciones a nivel internacional apuntan a estrategias de monitoreo temprano como la opción más económica y efectiva que permite ejecutar planes anticipados de prevención. Sin embargo, una de las principales barreras en el control y contención de las EEI es la inexistencia de sistemas de monitoreo adecuados y la dificultad de movilizar recursos para su ejecución. Es por esto, que urge la necesidad de crear sistemas de monitoreo económicos, rápidos y eficientes que permitan una temprana identificación de EEI en terreno. En este trabajo se presenta el desarrollo de recursos biológicos, hardware y software de libre acceso para el monitoreo de ADN ambiental en ecosistemas hídricos, enfocado principalmente en la detección de Castor Canadensis. Esto incluye el desarrollo de herramientas moleculares accesibles localmente, la elaboración y optimización de reacciones LAMP caseras y a bajo costo, la selección de targets y diseño de primers específicos para mejorar el desempeño de las reacciones con muestras ambientales, la validación de ensayos LAMP para la detección de Castor Canadensis, y la elaboración de equipamiento y software de libre acceso para el registro y análisis de señales fluorescentes. Los resultados de esta tesis demuestran la detección molecular de ADN de Castor Canadensis a bajo costo y de manera descentralizada gracias a los insumos producidos de manera local y el desarrollo de herramientas de libre acceso de hardware y software. Además, el desempeño de estas reacciones fue comparable con los kits comerciales en términos de sensibilidad y especificidad, constituyéndose como una alternativa más económica para el diagnóstico molecular. Se espera continuar con la optimización y evaluación, tanto de las reacciones LAMP como el equipamiento, con muestras ambientales, lo que podría permitir avanzar en xii el desarrollo y aplicabilidad de las técnicas de detección molecular en terreno, la vigilancia epidemiológica y/o la conservación de especies.
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    Low cost and open source multi-fluorescence imaging system for teaching and research in biology and bioengineering
    (2017) Núñez Quijada, Isaac Natán; Matute Torres, Tamara Francisca; Herrera, Roberto; Keymer, Juan MI.; Marzullo, Timothy; Rudge, Timothy; Federici, Fernán
    The advent of easy-to-use open source microcontrollers, off-the-shelf electronics and customizable manufacturing technologies has facilitated the development of inexpensive scientific devices and laboratory equipment. In this study, we describe an imaging system that integrates low-cost and open-source hardware, software and genetic resources. The multi-fluorescence imaging system consists of readily available 470 nm LEDs, a Raspberry Pi camera and a set of filters made with low cost acrylics. This device allows imaging in scales ranging from single colonies to entire plates. We developed a set of genetic components (e.g. promoters, coding sequences, terminators) and vectors following the standard framework of Golden Gate, which allowed the fabrication of genetic constructs in a combinatorial, low cost and robust manner. In order to provide simultaneous imaging of multiple wavelength signals, we screened a series of long stokes shift fluorescent proteins that could be combined with cyan/green fluorescent proteins. We found CyOFP1, mBeRFP and sfGFP to be the most compatible set for 3-channel fluorescent imaging. We developed open source Python code to operate the hardware to run time-lapse experiments with automated control of illumination and camera and a Python module to analyze data and extract meaningful biological information. To demonstrate the potential application of this integral system, we tested its performance on a diverse range of imaging assays often used in disciplines such as microbial ecology, microbiology and synthetic biology. We also assessed its potential use in a high school environment to teach biology, hardware design, optics, and programming. Together, these results demonstrate the successful integration of open source hardware, software, genetic resources and customizable manufacturing to obtain a powerful, low cost and robust system for education, scientific research and bioengineering. All the resources developed here are available under open source licenses.
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    Universal loop assembly: open, efficient and cross-kingdom DNA fabrication.
    (2020) Pollak, Bernardo; Matute Torres, Tamara Francisca; Núñez Quijada, Isaac Natán; Cerda Rojas, Ariel; López Sierra, Constanza Andrea; Vargas Torres, Valentina Isabel; Kan, Anton; Bielinski,Vincent; Dassow, Peter von; Dupont, Chris L.; Federici, Fernán
    Standardized type IIS DNA assembly methods are becoming essential for biological engineering and research. These methods are becoming widespread and more accessible due to the proposition of a 'common syntax' that enables higher interoperability between DNA libraries. Currently, Golden Gate (GG)-based assembly systems, originally implemented in hostspecific vectors, are being made compatible with multiple organisms. We have recently developed the GG-based Loop assembly system for plants, which uses a small library and an intuitive strategy for hierarchical fabrication of large DNA constructs (>30 kb). Here, we describe 'universal Loop' (uLoop) assembly, a system based on Loop assembly for use in potentially any organismof choice. This design permits the use of a compact number of plasmids (two sets of four odd and even vectors), which are utilized repeatedly in alternating steps. The elements required for transformation/maintenance in target organisms are also assembled as standardized parts, enabling customization of host-specific plasmids. Decoupling of the Loop assembly logic from the host-specific propagation elements enables universal DNA assembly that retains high efficiency regardless of the final host. As a proof-of-concept, we show the engineering of multigene expression vectors in diatoms, yeast, plants and bacteria. These resources are available through the OpenMTA for unrestricted sharing and open access.