Browsing by Author "Núñez Quijada, Isaac Natán"

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    Artificial Symmetry-Breaking for Morphogenetic Engineering Bacterial Colonies
    (2017) Núñez Quijada, Isaac Natán; Matute Torres, Tamara Francisca; Del Valle, Ilenne D.; Kan, Anton; Choksi, Atri; Endy, Drew; Haseloff, Jim; Rudge, Timothy; Federici, Fernán
    Morphogenetic engineering is an emerging field that explores the design and implementation of self-organized patterns, morphologies, and architectures in systems composed of multiple agents such as cells and swarm robots. Synthetic biology, on the other hand, aims to develop tools and formalisms that increase reproducibility, tractability, and efficiency in the engineering of biological systems. We seek to apply synthetic biology approaches to the engineering of morphologies in multicellular systems. Here, we describe the engineering of two mechanisms, symmetry-breaking and domain-specific cell regulation, as elementary functions for the prototyping of morphogenetic instructions in bacterial colonies. The former represents an artificial patterning mechanism based on plasmid segregation while the latter plays the role of artificial cell differentiation by spatial colocalization of ubiquitous and segregated components. This separation of patterning from actuation facilitates the design-build-test-improve engineering cycle. We created computational modules for CellModeller representing these basic functions and used it to guide the design process and explore the design space in silico. We applied these tools to encode spatially structured functions such as metabolic complementation, RNAPT7 gene expression, and CRISPRi/Cas9 regulation. Finally, as a proof of concept, we used CRISPRi/Cas technology to regulate cell growth by controlling methionine synthesis. These mechanisms start from single cells enabling the study of morphogenetic principles and the engineering of novel population scale structures from the bottom up.
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    Diseño e implementación de funciones biológicas elementales en colonias bacterianas para la ingeniería de morfogénesis
    (2017) Núñez Quijada, Isaac Natán; Federici, Fernán; Rudge, Timothy; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
    La ingeniería biológica se constituye sobre la dicotomía entre el enfoque estructurado y determinista de la ingeniería, y la naturaleza autoorganizada y estocástica de los sistemas biológicos que utiliza. La ingeniería morfogenética se define en medio de este conflicto, aprovechando el potencial de la autoorganización para formar sistemas altamente estructurados, mediante la manipulación de las unidades que los componen y definen. Por otra parte, la biología sintética pretende crear herramientas y formalismos para mejorar la trazabilidad y capacidad de diseño del sustrato biológico. En esta tesis se exploran estas dos áreas para crear una plataforma de prototipado de funciones morfogéneticas, que permita tanto estudiar sus principios como diseñar estructuras de nivel superior a partir de la programación de una célula fundadora. Para este fin, se propone desacoplar la morfogénesis en funciones elementales modulares, como lo son la ruptura de simetría y la regulación celular dominio específica. Concretamente, se desarrolló un sistema genético en dos capas: una formadora de patrones, fundamentada en la segregación de instrucciones celulares, y otra capaz de modificar el comportamiento celular en base a la interacción con los componentes co-localizados de la primera capa. Estas funciones fueron incluidas como módulos computacionales en CellModeller, lo que permitió explorar in silico su funcionamiento y guiar el diseño. Este enfoque de desacoplamiento y exploración computacional, unido a la inclusión de un sistema modular y combinatorial de ensamblaje de ADN, facilitaron el ciclo de “diseño, fabricación y testeo” de funciones morfogenéticas. Para poder aplicar estas herramientas, en primer lugar, se testeó y estableció su funcionamiento de manera independiente. Luego, se prototiparon funciones simples como “expresión genética dominio específica” mediante RNAPT7 y complementación metabólica. Finalmente, como prueba de concepto, se utilizó un sistema CRISPRi capaz de regular la tasa de crecimiento celular para modificar la morfología de las colonias bacterianas.
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    Ingeniería de patrones autoorganizados complejos en poblaciones celulares creciendo en superficie
    (2023) Núñez Quijada, Isaac Natán; Federici, Fernán; Ramírez Sarmiento, César Antonio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
    La organización espacial de tipos celulares coordinados desempeña un papel crítico en el funcionamiento de los sistemas biológicos y la aparición de propiedades emergentes de mayor nivel. Esta estructuración ocurre a través de procesos que operan a diferentes escalas, involucrando la integración de señales locales y globales que establecen una relación entre el nivel micro y macro. Las aproximaciones clásicas para comprender la organización multicelular están restringidas a la capacidad de análisis de los sistemas biológicos existentes en la naturaleza. Sin embargo, debido al elevado número de componentes y la complejidad de sus interacciones, resulta difícil establecer reglas generales que gobiernen este proceso. La biología sintética plantea un enfoque alternativo para abordar el estudio de la organización multicelular. Este enfoque busca explorar los principios y mecanismos fundamentales de manera constructiva (bottom-up) mediante la creación y estudio de sistemas artificiales mínimos y altamente trazables. En este trabajo se presenta el desarrollo de un sistema modular, tanto a nivel de hardware como biológico, para el estudio y control de la organización de estados en arreglos celulares que surge de la integración de procesos biológicos de interacción local y global. Para ello, se estableció el modelo de Ising como marco conceptual capaz de representar estos procesos, y la utilización de colonias de E.coli como arreglos celulares de fácil manipulación experimental y genética. Se desarrolló un sistema de ensamblaje de ADN eficiente, recursivo y combinatorial, así como una librería de recursos genéticos modulares para la elaboración de unidades transcripcionales, regulación optogenética e integración al genoma. Mediante estos recursos fue posible elaborar redes genéticas sintéticas (SGN) que capturan las propiedades del modelo de Ising. Estos diseños comprenden estados celulares de expresión genética biestable, que son determinados por efecto de un acoplamiento local basado en quorum sensing y la influencia de una señal externa mediada por regulación optogenética. Esta representación incluye de manera explícita el “campo externo” a través de una señal lumínica, que constituye un control de fácil manipulación sobre la organización del sistema. Con el fin de registrar la dinámica de estos arreglos celulares y efectuar su control genético mediado por luz, se desarrolló un equipo modular y especializado. Este demostró ser efectivo para recopilar datos de alta calidad y rendimiento sobre el crecimiento y la expresión genética de colonias bacterianas, así como en su regulación optogenética. El equipamiento diseñado es de código abierto y bajo costo, lo que facilita su adaptación y programación para llevar a cabo diversos regímenes experimentales según los requerimientos específicos de la investigación. En su conjunto, el sistema experimental desarrollado constituye una plataforma simple, asequible y versátil para estudiar fenómenos complejos de organización celular de manera trazable. Estos recursos permitieron avanzar en el diseño de un sistema biológico cuya autoorganización puede ser dirigida mediante el control de una señal de fácil manipulación. Se espera que esta plataforma facilite el estudio del modelo de Ising como formalismo para la ingeniería de patrones espaciales complejos, fundados en acoplamiento celular local y una señal de control externa homogénea. En términos prácticos, se espera que estas herramientas contribuyan a la comprensión de los principios que subyacen la organización multicelular y abran paso a nuevos paradigmas en el diseño de tejidos, órganos, biomateriales, biopelículas y bioprocesos
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    Low cost and open source multi-fluorescence imaging system for teaching and research in biology and bioengineering
    (2017) Núñez Quijada, Isaac Natán; Matute Torres, Tamara Francisca; Herrera, Roberto; Keymer, Juan MI.; Marzullo, Timothy; Rudge, Timothy; Federici, Fernán
    The advent of easy-to-use open source microcontrollers, off-the-shelf electronics and customizable manufacturing technologies has facilitated the development of inexpensive scientific devices and laboratory equipment. In this study, we describe an imaging system that integrates low-cost and open-source hardware, software and genetic resources. The multi-fluorescence imaging system consists of readily available 470 nm LEDs, a Raspberry Pi camera and a set of filters made with low cost acrylics. This device allows imaging in scales ranging from single colonies to entire plates. We developed a set of genetic components (e.g. promoters, coding sequences, terminators) and vectors following the standard framework of Golden Gate, which allowed the fabrication of genetic constructs in a combinatorial, low cost and robust manner. In order to provide simultaneous imaging of multiple wavelength signals, we screened a series of long stokes shift fluorescent proteins that could be combined with cyan/green fluorescent proteins. We found CyOFP1, mBeRFP and sfGFP to be the most compatible set for 3-channel fluorescent imaging. We developed open source Python code to operate the hardware to run time-lapse experiments with automated control of illumination and camera and a Python module to analyze data and extract meaningful biological information. To demonstrate the potential application of this integral system, we tested its performance on a diverse range of imaging assays often used in disciplines such as microbial ecology, microbiology and synthetic biology. We also assessed its potential use in a high school environment to teach biology, hardware design, optics, and programming. Together, these results demonstrate the successful integration of open source hardware, software, genetic resources and customizable manufacturing to obtain a powerful, low cost and robust system for education, scientific research and bioengineering. All the resources developed here are available under open source licenses.
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    Universal loop assembly: open, efficient and cross-kingdom DNA fabrication.
    (2020) Pollak, Bernardo; Matute Torres, Tamara Francisca; Núñez Quijada, Isaac Natán; Cerda Rojas, Ariel; López Sierra, Constanza Andrea; Vargas Torres, Valentina Isabel; Kan, Anton; Bielinski,Vincent; Dassow, Peter von; Dupont, Chris L.; Federici, Fernán
    Standardized type IIS DNA assembly methods are becoming essential for biological engineering and research. These methods are becoming widespread and more accessible due to the proposition of a 'common syntax' that enables higher interoperability between DNA libraries. Currently, Golden Gate (GG)-based assembly systems, originally implemented in hostspecific vectors, are being made compatible with multiple organisms. We have recently developed the GG-based Loop assembly system for plants, which uses a small library and an intuitive strategy for hierarchical fabrication of large DNA constructs (>30 kb). Here, we describe 'universal Loop' (uLoop) assembly, a system based on Loop assembly for use in potentially any organismof choice. This design permits the use of a compact number of plasmids (two sets of four odd and even vectors), which are utilized repeatedly in alternating steps. The elements required for transformation/maintenance in target organisms are also assembled as standardized parts, enabling customization of host-specific plasmids. Decoupling of the Loop assembly logic from the host-specific propagation elements enables universal DNA assembly that retains high efficiency regardless of the final host. As a proof-of-concept, we show the engineering of multigene expression vectors in diatoms, yeast, plants and bacteria. These resources are available through the OpenMTA for unrestricted sharing and open access.