Browsing by Author "Peñailillo Lazo, Johany Freddy"

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    Análisis de los cambios tempranos del transcriptoma en respuesta al daño en la médula espinal de Xenopus laevis.
    (2019) Peñailillo Lazo, Johany Freddy; Larraín Correa, Juan Agustín; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
    A diferencia de los mamíferos, otros animales como las larvas de anfibios anuros (donde se incluye a Xenopus) pueden lograr una recuperación funcional completa después de una lesión en la médula espinal. En nuestro laboratorio, se ha establecido a la rana Xenopus laevis (X. laevis) como un organismo modelo para estudiar la regeneración de la médula espinal. Una de las principales ventajas de X. laevis es que las larvas en etapas 50-54 (estadios-R) pueden recuperarse anatómica, histológica y funcionalmente después de una lesión en la médula espinal (LME). Esas habilidades se pierden por completo en las ranas juveniles (estadio-NR). La zona ependimaria del canal central de la médula espinal de las larvas en estadios-R presenta un alto porcentaje de células progenitoras neuronales (NPC) Sox2+. Estas se activan rápidamente en respuesta a una lesión y son necesarias para lograr la regeneración completa de la médula espinal. Nuestro interés es identificar las redes genéticas y las vías de señalización involucradas en la activación temprana de NPC. Para identificar los mecanismos y las vías de señalización involucradas en la activación de células Sox2+, hemos realizado un análisis de los cambios del transcriptoma durante las primeras 21 horas posteriores a la transección (hpt) en animales en estadios-R. Con este objetivo, el tejido del sitio de la lesión se aisló cada 1 hora luego de la lesión en animales transectados, así como también en animales control, con daño simulado (sham) y sin daño. Como resultado de este muestreo y posterior secuenciación de ARNm conseguimos más de 100 librerías de RNA-seq, con las cuales se realizó un exhaustivo análisis bioinformático. Los genes expresados diferencialmente (GEDs) se identificaron mediante Procesos Gaussianos. Posteriormente, la estructura modular de los GEDs se infirió utilizando un Análisis de redes de Co-expresión Génica Ponderada (WGCNA). Estos módulos de co-expresión fueron analizados buscando procesos biológicos y vías de señalización KEGG enriquecidas. Además, analizamos los motivos de unión al ADN de factor de transcripción enriquecidos en el promotor proximal de genes coexpresados y las interacciones proteína-proteína entre los GEDs. Identificamos 1850 GEDs que se agruparon en 11 módulos de coexpresión (3 regulados negativamente, 2 regulados positivamente con una activación inmediata, 3 regulados positivamente con una activación intermedia y 3 regulados positivamente con una activación tardía). El análisis de ontología génica reportó: (1) un enriquecimiento de los reguladores negativos de la señalización mTOR en los primeros módulos regulados negativamente, (2) un aumento en factores de transcripción en los módulos de activación inmediata, (3) un aumento en los componentes de la biogénesis del ribosoma en módulos de activación intermedia y (4) un aumento en genes asociados a división de células progenitoras y de ciclo celular en módulos de activación tardía. En base a nuestros análisis bioinformáticos decidimos estudiar el rol de la vía mTOR durante las primeras horas luego de la transección. Análisis por Western Blot e Inmunofluorescencia contra p-S6, la forma activa de un componente intracelular de la vía mTOR, mostraron una activación rápida a las 3 hpt y principalmente en las células de la zona ependimaria del canal central cercanas al sitio de la lesión y los cuerpos neuronales a lo largo del sistema nervioso. La inhibición de esta vía de señalización utilizando rapamicina bloquea la proliferación de células Sox2+ y la recuperación funcional después de la LME. Estos resultados sugieren un papel clave para la vía mTOR en la rápida activación de las células Sox2+ para una adecuada recuperación después de la LME en renacuajos. De esta manera, podemos concluir que identificamos cambios tempranos en el transcriptoma de la médula espinal en respuesta al daño a la médula espinal, los cuales pueden ser asociados a varios procesos biológicos y vías de señalización que se despliegan en ondas transcripcionales secuenciales después de la LME. Finalmente, análisis bioinformáticos y pruebas funcionales de la vía mTOR sugieren que esta vía de señalización sería clave durante las primeras horas de la regeneración de la médula espinal.
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    Cellular response to spinal cord injury in regenerative and non-regenerative stages in Xenopus laevis
    (2021) Edwards Faret, Gabriela Andrea; González Pinto, Karina; Cebrián Silla, Arantxa; Peñailillo Lazo, Johany Freddy; García Verdugo, José Manuel; Larraín Correa, Juan Agustín
    Abstract Background The efficient regenerative abilities at larvae stages followed by a non-regenerative response after metamorphosis in froglets makes Xenopus an ideal model organism to understand the cellular responses leading to spinal cord regeneration. Methods We compared the cellular response to spinal cord injury between the regenerative and non-regenerative stages of Xenopus laevis. For this analysis, we used electron microscopy, immunofluorescence and histological staining of the extracellular matrix. We generated two transgenic lines: i) the reporter line with the zebrafish GFAP regulatory regions driving the expression of EGFP, and ii) a cell specific inducible ablation line with the same GFAP regulatory regions. In addition, we used FACS to isolate EGFP+ cells for RNAseq analysis. Results In regenerative stage animals, spinal cord regeneration triggers a rapid sealing of the injured stumps, followed by proliferation of cells lining the central canal, and formation of rosette-like structures in the ablation gap. In addition, the central canal is filled by cells with similar morphology to the cells lining the central canal, neurons, axons, and even synaptic structures. Regeneration is almost completed after 20 days post injury. In non-regenerative stage animals, mostly damaged tissue was observed, without clear closure of the stumps. The ablation gap was filled with fibroblast-like cells, and deposition of extracellular matrix components. No reconstruction of the spinal cord was observed even after 40 days post injury. Cellular markers analysis confirmed these histological differences, a transient increase of vimentin, fibronectin and collagen was detected in regenerative stages, contrary to a sustained accumulation of most of these markers, including chondroitin sulfate proteoglycans in the NR-stage. The zebrafish GFAP transgenic line was validated, and we have demonstrated that is a very reliable and new tool to study the role of neural stem progenitor cells (NSPCs). RNASeq of GFAP::EGFP cells has allowed us to clearly demonstrate that indeed these cells are NSPCs. On the contrary, the GFAP::EGFP transgene is mainly expressed in astrocytes in non-regenerative stages. During regenerative stages, spinal cord injury activates proliferation of NSPCs, and we found that are mainly differentiated into neurons and glial cells. Specific ablation of these cells abolished proper regeneration, confirming that NSPCs cells are necessary for functional regeneration of the spinal cord. Conclusions The cellular response to spinal cord injury in regenerative and non-regenerative stages is profoundly different between both stages. A key hallmark of the regenerative response is the activation of NSPCs, which massively proliferate, and are differentiated into neurons to reconstruct the spinal cord. Also very notably, no glial scar formation is observed in regenerative stages, but a transient, glial scar-like structure is formed in non-regenerative stage animals.