Quasispecies diversity and its role in the virulence of the human influenza A virus.
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2019
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Abstract
El virus de influenza estacional infectan entre el 5 y el 15% de la población humana cada año,
lo que resulta en ∼500,000 muertes en todo el mundo. El virus de influenza estacional está
asociada con dos tipos de virus de influenza: A (IAV) y B (IBV). Los virus de influenza
pertenecen a la familia de virus Orthomyxoviridae que tienen genomas de ARN de sentido
negativo, monocatenarios y segmentados. La segmentación del genoma, permite que el virus
intercambie segmentos enteros con otras cepas, lo que facilita los saltos zoonóticos y aumenta
la evolución y diversidad viral. Además, debido su polimerasa es propensa a errores debido a
su falta de capacidad de corrección, se puede generar una diversidad considerable durante la
replicación viral, que genera cambios graduales de nucleótidos que pueden acumularse con el
tiempo. Estas fuentes de diversidad son fundamentales para la evolución del virus de la influenza
y se han relacionado con marcadores que aumentan la patogénesis. La aparición de cepas
pandémicas, las epidemias anuales y las variantes resisitentes a antivirales son ejemplos de
cómo la diversidad genética impacta en la virulencia del patógeno. La diversidad de IAV, su
arquitectura segmentada, el tamaño de la población y las coinfecciones generan las condiciones
para que puedan ocurrir interacciones entre variantes genéticas. En este contexto, la teoría de
las cuasiespecies puede contribuir a nuestra comprensión de la dinámica que puede surgir
durante las infecciones por IAV. Las cuasiespecies virales se definen como la colección de
genomas virales relacionados, sujetos a procesos continuos de variación genética, competencia
y selección de la distribución con mayor “fitness”. En el modelo propuesto, tales interacciones
entre los miembros de una cuasiespecie alcanzan un estado donde coexisten en un cuasi
equilibrio que, en general, beneficia a toda la población. El desarrollo y las mejoras de las
tecnologías de secuenciación, generando lecturas más largas y mayor profundidad, brindan nuevas oportunidades para estudiar las cuasiespecies virales. La mayor parte de la investigación
se ha centrado en la validación experimental de conceptos introducidos por la teoría de la
quasiespecie (es decir, umbral de error, robustez mutacional); para el IAV no existe una
descripción clara ni una definición pragmática de las cuasiespecies en el contexto de una
infección natural y su posible papel en la patogénesis. En esta tesis, investigamos si la diversidad
de cuasiespecies virales modulan la virulencia de IAV. En primer lugar, para comprender mejor
la diferencia entre las variantes de virus desde un enfoque funcional, desarrollamos un pipeline
bioinformático. El IAV es un patógeno que ha captado la atención de los investigadores durante
décadas, y como resultado de eso, hay una cantidad importante y una gran variedad de
información. Para la mayoría de sus proteínas se cuenta con una o más estructuras de
cristalografía y hay descripciones precisas con evidencia experimental que asocian funciones a
diferentes regiones de cada proteína. Nuestro pipeline utiliza esta información resaltando las
diferencias de nucleótidos en comparación con una secuencia de consenso, lo que proporciona
una mejor comprensión de las funciones de la proteína que podrían verse afectadas en
comparación con la secuencia de consenso. En segundo lugar, utilizamos este pipeline para
analizar las variantes virales observadas en las secuencias de IAV obtenidas de individuos
graves. Esto nos permitió identificar un nuevo aminoácido en la NA que confiere resistencia al
antiviral oseltamivir. También identificamos cambios en la HA que probablemente ayuden a
evadir la inmunidad preexistente (respuestas de anticuerpos) en un sujeto en particular, lo que
sugiere que se trata de una deriva antigénica intra-huésped. Además, estos cambios se detectaron
como poblaciones mixtas en muestras secuenciales, lo que indica un cambio dinámico en el
tiempo del genoma de IAV. Finalmente, describimos la diversidad de las cuasiespecies
experimentalmente in vitro e in vivo en humanos. Usando una combinación de los métodos de secuenciación Illumina y PacBio, medimos las poblaciones virales durante el curso de la
infección cuando el IAV se pasó en diferentes sustratos celulares hasta 10 veces. Nuestros
análisis revelaron la presencia de un número limitado de variantes IAV, que fluctuaron a lo largo
de los pasajes y las réplicas biológicas. La mayoría de las variaciones de un solo nucleótido
(SNV) se encontraron a baja frecuencia y rara vez se compartieron entre las réplicas. Sin
embargo, encontramos SNV que se fijaron en los ultimos pasajes y, casi siempre, conllevaron
un cambio de aminoácidos. Los datos sugieren que, típicamente, había un único genotipo
dominante. La diversidad genética se evaluó en individuos infectados con IAV pertenecientes a
un grupo severo o a uno no severo. Nuestros análisis genómicos indican una tendencia a tener
más SNV en el grupo severo que en el no severo. En el grupo severo, solo el 25% de los SNV
fueron de ocurrencia única en un segmento, mientras que el 45% en los no severos, lo que
sugiere una dinámica genética diferente entre los dos grupos. Al igual que lo sucedido in vitro,
generalmente un genotipo es el dominante en cada paciente. Nuestros resultados indican que las
diversidad en las cuasiespecies alcanzarón altos niveles en casos particulares, pero a modo
general para cada segemento, no hubo diferencias en diversidad entre el grupo grave y el no
grave. Adicionalmente, se encontraron haplotipos alternativos con alta frecuencia en
experimentos in vitro e in vivo, pero según los datos obtenidos de los pasajes celulares, es muy
probable que sea un estado transitorio. Por lo tanto, esta investigación contribuye a la
comprensión de cómo se generan las cuasiespecies y sugiere que los factores del sustrato y / o
huésped, probablemente contribuyan a la diversidad viral intrínseca y a la capacidad de
replicación.
Description
Tesis (Doctor en Ciencias con mención en Genética Molecular y Microbiología)--Pontificia Universidad Católica de Chile, 2019