Phenotype based discovery of selected oxidoreductases for the utilization of renewable resources
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2021
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Abstract
El descubrimiento de nuevos biocatalizadores que se adapten a diversas condiciones de proceso es fundamental para implementar la biocatálisis a nivel industrial. Una técnica valiosa para buscar nuevas enzimas es el descubrimiento basado en el fenotipo, en el que las características que se
encuentran en el hábitat de un organismo se utilizan como un indicador de la presencia de enzimas que funcionan en esas condiciones. El mismo razonamiento puede ser utilizado al encontrar un producto de interés en el ambiente: probablemente los organismos que viven allí producen enzimas
capaces de sintetizar y degradar estos compuestos. Posteriormente, se pueden aplicar técnicas de ingeniería de proteínas a las nuevas enzimas y mejorar más aún sus características. En este trabajo, se utilizó el descubrimiento basado en fenotipo para identificar nuevas oxidorreductasas con características de relevancia industrial. La investigación se centró en encontrar nuevos miembros de dos familias: monooxigenasas de Bayer-Villiger (BVMO) y borneol deshidrogenasas de cadena corta (BDH). En el caso de BVMO, la búsqueda en el genoma de microorganismos antárticos condujo al descubrimiento de una monooxigenasa activa en frío. La enzima muestra una temperatura óptima de 20°C, presenta un 70% de su actividad óptima a 5°C y tiene una buena tolerancia a solventes orgánicos. La enzima muestra promiscuidad de cofactor y cataliza la monooxigenación de sustratos como norcamphor y biciclo[3.2.0]hept-2-en-6-ona de manera regio y enantioselectiva.
En el caso de la familia de BDH, se realizó una búsqueda en el genoma de plantas que contienen un alto porcentaje de borneol o alcanfor en sus aceites esenciales, lo que condujo al descubrimiento de enzimas capaces de catalizar la oxidación de borneol de forma enantioespecífica. Algunas de estas enzimas también catalizan la reducción de alcanfor de manera diastereoselectiva. La
determinación de las estructuras tridimensionales de dos de estas enzimas permitió estudiar los determinantes estructurales de la especificidad y selectividad. Se utilizó comparación de secuencias, comparación de estructuras, acoplamiento molecular y mutagénesis dirigida para dilucidar la
influencia de los residuos del sitio activo en estas características. También se utilizó reconstrucción de secuencias ancestrales para estudiar la historia evolutiva de esta familia en términos de especificidad y termoestabilidad. Esto llevó a la caracterización de ancestros con una especificidad moderada, en contraste con las enzimas existentes, que presentan una especificidad muy alta (E>200) o baja.
Description
Tesis (Doctor in Engineering Sciences)--Pontificia Universidad Católica de Chile, 2021
Tesis (Doctor of Natural Sciences)--Graz University of Technology, 2021
Tesis (Doctor of Natural Sciences)--Graz University of Technology, 2021