Participación de los canales formados por pannexinas en la fisiología del espermatozoide de ratón
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2015
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Abstract
La espermatogenesis es un proceso donde células primordiales (espermatogonias) se multiplican y diferencian en espermatozoides. Este proceso tiene lugar en los túbulos seminíferos y es regulado por diferentes señales paracrinas. Una vez producidos los espermatozoides en el testículo, deben madurar en el epidídimo y adquirir la capacidad de fecundar un ovocito, ya sea en el tracto genital femenino o bajo condiciones controladas in vitro (evento conocido como capacitación). Durante la capacitación se producen cambios relacionados con la permeabilidad de la membrana plasmática que llevan a cambios graduales en el Ca2+ intracelular, hiperpolarización del potencial de membrana, liberación de colesterol, hiperactivación de la motilidad, activación de la adenilato ciclasa soluble, formación de AMPc y activación de la proteína quinasa A (PKA). Estos eventos preparan al espermatozoide para el punto final de la capacitación: “la reacción del acrosoma (RA)”. La RA es un proceso exocítico que depende de Ca2+, donde las enzimas acrosomales son liberadas al espacio extracelular. Este fenómeno puede ser inducido por diferentes factores presentes en el tracto genital femenino como progesterona (P4) o zona pelúcida (ZP), u ocurrir espontáneamente. Estudios previos de nuestro laboratorio muestran la presencia de pannexinas (Panx) en túbulos seminíferos y células germinales.Las Panx son proteínas que forman canales no selectivos y que podrían relacionarse con la movilización de iones y moléculas claves en la capacitación y RA. Sin embargo, su presencia, localización y actividad en espermatozoides no han sido estudiadas. En otros sistemas, los canales formados por Panx se asocian a señalización por Ca2+ luego de la estimulación de receptores activados por adenosina trifosfato (ATP) extracelular. Dada esta propiedad, y ya que el ATP, es un inductor de la RA en espermatozoides de toro y humano, es que en esta tesis se utilizó al ATP como un inductor de la RA en espermatozoides de ratón, permitiendo estudiar la participación de las Panx en los mecanismos de capacitación y RA. Por lo tanto, en esta tesis se propuso la siguiente hipótesis: “las Panx participan en la capacitación y reacción acrosomal del espermatozoide de ratón”, y para esto se planteó el siguiente objetivo general: “Estudiar la participación de las Panx en la capacitación y reacción acrosomal en espermatozoides de ratón”. Para cumplir este objetivo, los espermatozoides fueron extraídos de la cauda epididimaria de ratón, y la presencia y localización de las Panx fue determinada por Western Blot e IF respectivamente. La capacitación fue evaluada a través de estudios de colesterol de membrana con filipina, patrón de fosforilación de tirosina con Western blot, hiperpolarización del potencial de membrana con fluorometría e hiperactivación con sistema computarizado de análisis espermático (CASA).La RA fue inducida con P4, ZP y ATP. En todas las condiciones descritas anteriormente, los experimentos fueron realizados en presencia y ausencia de bloqueadores farmacológicos de los Panx o usando células del ratón knock-out de Panx1. Durante la capacitación y la reacción acrosomal se estudió permeabilidad de membrana como indicador de actividad de canales de Panx con la sonda fluorescente bromuro de etidio (BrEt). Además también fueron evaluadas señales de Ca2+ con FLUO3-AM. Los resultados de este trabajo muestran que las Panx, están presentes de forma compartimentalizada en el espermatozoide de ratón, estando Panx1 y Panx2 preferentemente en la cola así como en la región postacrosomal, mientras que Panx3 en la región acrosomal, sugiriendo una participación diferencial en las distintas etapas de la capacitación y RA. Los estudios de capacitación muestran que existe actividad incrementada de los canales de Panx, y que la inhibición farmacológica previene la liberación del colesterol desde la cola del espermatozoide, depolariza el potencial de membrana, sin afectar al patrón de fosforilación en tirosina así como la hiperactivación espermática. En RA, en tanto, se caracterizó al ATP como un inductor de la RA estudiando tanto el mecanismo de inducción de ATP como el de P4. Siendo esta molécula junto con la P4 dependientes de la activación de canales de Panx. Todos estos resultados muestran a las Panx como moduladores de diferentes mecanismos de capacitación y RA. Por medio de este estudio, identificamos nuevas herramientas biotecnológicas para el estudio de fertilidad en animales de interés económico y humanos.
Description
Tesis (Doctor en Ciencias Biológicas, mención en Ciencias Fisiológicas)--Pontificia Universidad Católica de Chile, 2015