Identificación y caracterización de genes de proteínas con repeticiones de pentatricopéptidos (PPR) necesarias para la edición de transcritos mitocondriales en Arabidopsis thaliana
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Date
2015
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Abstract
La edición de RNA es un tipo de procesamieto post-transcripcional que altera la identidad de nucleótidos en las moléculas de RNA. En organelos de plantas con flores, la edición de RNA cambia citosinas a uracilos. Más de 400 sitios en mitocondrias de angiospermas son individualmente identificados por proteínas altamente específicas, pero ninguno de estos factores están codificados en el genoma mitocondrial. Todos estos factores de reconocimiento pertenecen a la familia de proteínas con repeticiones de pentatricopéptido (PPR). El principal objetivo de este trabajo es identificar nuevos Factores de Edición Mitocondrial (MEFs). Para lograr este objetivo, se utilizaron los siguientes criterios: (i) Disponibilidad de secuencias de ESTs o cDNAs de genes PPR en bases de datos, (ii) destinación mitocondrial predicha por distintos algoritmos, (iii) proteínas PPR pertenecientes a la subfamilia PLS con motivos E, E+ o DYW, y (iv) reducida identidad de secuencia con otras proteínas PPR de Arabidopsis. Utilizando estos criterios, cinco genes PPR candidatos fueron seleccionados. Tres de nuestros candidatos, en experimentos de localización subcelular muestran localización en mitocondrias. Plantas mutantes homocigotas en cada uno de los genes candidatos fueron analizadas con la aproximación de SNaPshot. Esta metodología permite evaluar masivamente los niveles de edición en organelos de Arabidopsis, encontrando alteraciones en la edición de diversos transcritos mitocondriales en tres líneas mutantes analizadas. Desde ese momento las proteínas codificados por los genes candidatos fueron nombradas MEF25, MEF26 y MEF31. MEF25 participa en la edición de un sitio en el transcrito nad1. MEF26 es necesaria para la edición completa del sitio cox3-311 y de la edición parcial del sitio nad4-166. MEF31 facilita la edición de un sitio en el transcrito orfX.Los defectos en la edición en las mutantes mef25, mef26 and mef31 fueron confirmados por secuenciación de productos de RT-PCR, análisis de una segunda línea mutante o ensayos de complementación. La edición de los sitios diana de estos factores MEF genera un cambio en la naturaleza del aminoácido que finalmente estará presente en la proteína funcional. Sin embargo, el fenotipo de las plantas mutantes mef25, mef26 and mef31 es indistinguibles de las plantas silvestres, sugiriendo que la edición de sus sitios diana no es esencial al menos bajo condiciones estándar de crecimiento. Por otra parte, recientemente ha sido propuesto un código para el reconocimiento del RNA mediado por las proteínas PPR. Usando este código, los dianas predichos para los factores MEF25, MEF26 y MEF31 son coincidentes con los dianas experimentales identificados en este estudio.
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Tesis (Doctor en Ciencias Biológicas, mención Genética Molecular y Microbiología)--Pontificia Universidad Católica de Chile, 2015